미생물의 배양과 현미경의 종류

5. 4 미생물의 배양

 

5.4.1 배양 배지

 

대기 중에 에서 실시하는 대다수의 세균은 액체나 고체 배양 배지에서 자라거나 유지될 수 있다. 대부분 고체배지의 기본은 한천(agar)이라 불리는 바닷말의 추출물로서 상업적으로 가루형태로 이용 가능하다. 한천은 뜨거운 물에서 용해되며 42°C 이하로 낮추면 굳은 젤 (gel)을 형성한다. 100°C까지 열을 가하면 다시 녹는다. 한천은 배지에 들어가는 적 당한 영양성분들과 함께 고압 멸균하며 고체화되기 이전에 시험관이나 페트리 접시에 붓는다.

 

한천은 영양적으로 불활성이기 때문에 성장하기 위한 단순한 고체 지지물로써 공급된다. 액체배지도 똑같은 영양물질을 기본으로 하고 있으나 한천은 첨가되어 있지 않다. 배지에는 배양하고자 하는 생명체가 자라는데 필요한 모든 에너지원과 영양분이 공급되어야 한다. 생명체의 상대적인 양을 토대로 볼 때 중요 영양 요구 물은 탄소, 주소, 산소, 질소, 인과 황이다. 부가적으로 칼슘, 철과 다른 금속이온들과 같은 미 량원소가 필요하다. 이들은 인과 함께 무기염으로 사용되나 다른 원소들의 이용은 그들의 화학적 형태에 따라 다르다. 탄소 형태에 따른 요구성은 미생물 영양에서 가장 복잡한 측면이다.

 

독립 영양체라 불리는 일부 미생물들은 중요 탄소원으로 이산화탄소를 사용한다. 대부분의 세균을 포함해 그 외의 미생물들은 유기화합물 형태의 탄소를 필요로 해서 종속 영양체라 한다 일부 생물체들은 질산염과 황산염으로부터 이들 원소를 얻을 수 있는 반면에 다른 생물체들은 무기염(NH+ 와 S2-)이나 아미노산, 펩티드(단백질의 분해산물)와 같은 유기화합물 내의 형태인 환원형을 이용한다.

 

유리 산소에 대한 요구성은 미생물을 분류하는데 중요한 특성이다. 원소로서 산소는 물이나 유기화합물의 구성성분으로 도처에 흔하다. 유리 산소는 호기성 호흡을 이용하는 많은 생물체의 성장에 중요하다. 혐기성 미생물은 산소를 필요로 하지 않으며 이것에 의해 억제되거나 죽을 수도 있다. 미생물 대사작용에서 중요 요소는 에너지원의 성질이다. 광 영양체는 항상 환원된 무기 화합물(NH3, NO2, Fe, H2S, S2 O3, H)을 이용하며 화학 독립 영양체는 탄소 원과 에너지원으로 유기화합물을 이용한다. 반면에 화학 종속 영양체는 탄소와 에너지원으로 유기화합물을 이용한다.

 

전형적인 배양 배지는 물, 특별한 유기화합물 형태 또는 복합물질[예; 펩톤(pep tone), 효모 추출물(yeast extract), 고기 추출물(meat extract)]형태로서 탄소원(독 림 영양체는 호기성 균의 성장에 필요한 산소를 공급해주는 대기로부터 이산화탄소를 얻는다)과 무기 또는 유기질소 화합물과 미량 영양물질을 포함하게 된다. pH의 과도한 변화로 인한 성장의 억제를 방지하기 위해서 배지는 완충되어야 한다. 이러한 제한 내에서 수백 개의 서로 다른 배양 배지는 구성성분이 매우 간단한 것으로부터 (예, 몇몇 독립 영양체의 성장을 지탱해 주는 무기염과 암모늄염이 있는 배지) 매우 복잡한 것까지 있는데 이러한 복합 배지 (complex media)에는 까다로운 미생물들이 합성할 수 없는 특이한 유기화합물과 성장 요소(비타민, 조효소)가 첨가되며 알려져 있지 않은 영양성분(펩톤, 효모 추출물)의 혼합물도 포함한다.

 

복합 배지는 다양한 종류의 미생물들을 배양하는데 이용된다. 일부 배지는 선택 배지 (selective media)로 만들어진다. 즉, 특별한 미생물이 필요로 하는 최소영 양요 구물을 첨가하거나 다른 집단이 자라지 못하도록 하는 요소들을 이용하거나 또는 두 가지 방법을 모두 이용하여 관찰의 대상이 되는 미생물이 유리하게 자라도록 고안되었다. 세균은 한천층의 표면과 안쪽에서 집락 (colony)의 형태로 자랄 수 있다. 운동성 세포들이 한천 표면의 수막을 따라 이동하 기 때문에 평판을 건조해 이를 제거한 후에야 명확하게 집락이 형성될 수 있다. 평판은 응축된 수분들이 한천 표면으로 떨어지는 것을 방지하기 위해 배양 동안 거 꾸로 방치해야 한다. 배양 온도는 존재하는 미생물의 형태에 따라 다양하다.

 

액체 시료에 있는 천연 개체군들은 25°C에서 배양되나 병원균은 37°C에서 배양되어야 한다. 한천 평판상에 분리된 집락은 주입 평판(pour plate)이나 분산 도말 평판(spread plate) 기술을 이용하여 세포 현탁액을 접종하여 얻는다. 주입 평판을 만들려면 0.1 ml 나 1.0 ml의 세포 현탁액을 접종하지 않은 페트리 접시에 피펫으로 옮기고, 녹인 한천 배지를 그 위에 붓는다. 한천이 굳기 전에 평판을 부드럽게 회전시켜 균과 한천이 잘 섞이도록 한다.

 

분산 도말 평판은 건조한 한천 평판 윗표면에 0.1 ml의 현탁액을 첨가하여 준비한다. 에탄올에 담갔다가 분젠 버너로 태워서 미리 멸균한 굽은 유 리봉(spreader)을 이용해 접종액을 평판의 표면에 골고루 퍼뜨린다. 후자 방법의 잇 점은 민감한 미생물이 치명적이거나 생장이 억제되는 녹은 한천의 온도에 노출되지 않으며, 산소의 확산에 의해 미생물들이 제한되지 않으며 미생물들을 쉽게 옮길 수 있게 모든 집락들은 표면에서 얻어질 수 있다.

 

한천 사면 (agar slope)은 녹은 한천을 작은 나사 뚜껑이 있는 병이나 시험관에 넣어 경사진 곳에 놓아서 만든다. 사면 배지는 주로 분리 균을 저장하거나 새로운 배양의 접종이나 진단 실험을 위해 표면 생장의 형태에서 균주를 제공하기 위하여 사용된다.

 

액체배양은 일반적으로 면화 솜으로 마개를 한 삼각 플라스크에서 자라며 특별한 균의 생장 기준을 연구하는 데 이용된다. 시험관이나 작은 나사 뚜껑이 있는 병에 들어 있는 액체배지는 가스 생산의 탐지가 요구되는 진단 시험을 포함해 특정한 진단 시 험들을 하는 데에도 사용된다. 가스탐지를 할 때는 고압멸균 시 시험관이나 병에 액 체로 가득 찬 작은 뒤집어 놓은 관(더람관, Durham tube)을 집어넣는다. 배양되는 동안에 가스 생성은 더람관에서의 기체의 포집을 통해서 확인될 수 있다.

 

5.4.3 순수배양의 분리

 

접종 물이 출발점에서 더 멀리 펼쳐질수록 각 세포들은 넓게 분포되므로 평판의 배양 후 최초의 접종 지역에서는 밀도 있고 겹쳐지는 생장이 관찰되고 그 후에는 점차 줄어들어 하나의 세포의 분열과 성장으로 형성되는 각각의 집락이 분리되어 나타나게 된다. 이 단계에서 명확한 집락이 나타난다고 해서 전체적으로 성공적인 분리를 의미하는 것은 아니다. 비록 육안으 로 보이지는 않지만 하나의 집락이 한 종류 이상의 균을 포함하고 있을 가능성이 있다.

 

단일 배양 배지가 시료에 있는 모든 종류의 균의 생장을 뒷받침하지 못하기 때문에 집락에는 하나 또는 두 종류의 활동하지 않는 오염균이 있을 가능성이 있으며 이 집락이 다른 배지에서 배양되기 위해서 사용된다면 이들 오염균은 자랄 수 있다. 그래서 단일 집락으로부터 재료를 취하고 순수배양을 확실하게 하기 위해서 이차 또는 삼차 도말 평판을 만드는 것이 일반적이다. 액체배양과 관련 있는 또 다른 유용한 기법은 농화(enrichment)이다.

 

선택 배지 (se lective medium)에 자연 상태의 개체군을 접종하고 흥미 있는 미생물의 성장에 알맞은 조건하에서 배양하면 영양원과 배양조건에 가장 적합한 미생물이 다른 것에 비 해 빨리 성장하여 시료에서 우점종 미생물(predominant organisms)이 될 것이다. 선택성의 정도에 따라서 이 기범으 매우 보장하 시로부터 알레르기 조르이 새문체 (resolving power)과 적용대상, 배율 등에 따라서 여러 가지 형태로 구분하여 사용할 수 있다.

 

5. 5.1 표준 광학현미경

 

미생물학적 연구에서 사용되는 대부분의 현미경은 표준 광학현미경 (standard light microscope)으로 2개의 렌즈인 대물렌즈(시료에 가까운 쪽)와 대안 렌즈로 된 복합형인데 렌즈를 통과한 빛이 그대로 눈에 들어오는 명시야(bright - field) 현미경 종류이다(그림 5.3). 렌즈들은 경통에 의해 분리되어서 대안 렌즈는 대물렌즈에 의해 형성되는 상을 확대한다. 대부분의 경우에 전체 배율은 대물렌즈의 배율에 대안 렌즈의 배율을 곱한 것이 된다.

 

현미경의 본질적 구성은 조명원, 시료를 올려놓는 검경대(stage)와 렌즈 시스템 그리고 시료 물체를 초점 안으로 가져오는 시료나 렌즈 체제를 움직이는 수단이다. 이들에 부가하여 대부분의 현대적인 현미경은 substage 콘덴서라고 불리는 시료 안으로 빛을 모으는 장치, 렌즈 체제로 들어오는 빛의 양을 조절하는 집광 조리개 (iris diaphragm), 그리고 여러 가지 정도의 배율을 제공하는 회전 터릿(rotating turret)에 올려진 2개 이상의 대물렌즈를 갖는다.

 

대부분의 강력한 대물렌즈는 유 침유(oil immersion) 대물렌즈로 약 100 배의 배율을 가지며 거의 1,000 배의 총 배 율을 가진다. 유 침유 렌즈는 렌즈와 슬라이드 사이에 한 방울의 특별한 유 침유가 초점 길이를 조절한다. 현미경 사용 시 빛 파장은 하나의 매질에서 (예, 유리) 다른 매 질(예, 공기)로 통과하면서 휘거나 굴절되는 경향이 있다. 굴절의 정도는 두 매질 사이에 수반되는 굴절율(index of refraction)의 차이에 의한다.

 

예를 들어, 유리의 굴절율은 1.51이고 물은 1.33 그리고 공기는 1.0이다. 유 침유의 굴절율은 유리의 굴 전율과 거의 같아 유리 슬라이드를 통과한 빛이 굴절하는 것을 막는다. 이러한 결 과는 대물렌즈에 더 많은 빛을 들어오게 하고 해상력을 증진시킨다. 이러한 현상은 그림 5.4에 도식하였다. 이 같이 세균 세포는 현미경하에서 매우 명백히 볼 수 있으나 자세한 세포 구조를 식별하기는 더욱 어렵다. 그러나 그들을 더 쉽게 볼 수 있게 하기 위해서 어떤 세 포 구조를 강화시킬 수 있는 기법들이 있다. 그에 대한 몇 가지 방법이 5.7절에 서 술 되어 있다.

 

5.5.2 암시야 현미경

 

현미경(darkfield microscope)의 발달은 살아있는 상태의 미생물을 효과적으로 관찰하는 방법을 제공하였다. 많은 미생물들 특히 염색하지 않은 세균은 매우 투명하여 세포와 밝은 배경 사이에 존재하는 대조(contrast)가 없기 때문에 관찰 하 기가 어렵다. 염색 과정에서 미생물은 죽게 되므로 운동성과 같은 특성을 결정하는 데 중요한 살아있는 세포의 관찰은 어렵다. 더욱이 이런 미생물(예, 스피로헤타)은 정상적인 염색방법에 의한 염색이 매우 어렵다. 염색하지 않은 미생물은 암시야 현 미경을 통해서 관찰할 수 있는데 Treponema pallidum과 같은 염색하기 어려운 세균의 관찰에 매우 유용하다. 암시야 현미경은 사용되는 콘덴서의 형태에 있어서 일반 광학현미경과 다르다.

 

암시야 현미경은 광학현미경에서 일반적으로 가지고 있는 아베(Abbe) 콘덴서의 위 치에 파라볼로이드(paraboloid) 콘덴서를 사용한다. 파라볼로이드 콘덴서는 원뿔형 태의 빛을 생성하는 가림판을 포함하여 대물렌즈를 통해 시료로 들어오는 빛을 차 단한다(그림 5.5). 그러나 시료를 통과하는 일부의 빛은 영상을 형성하도록 대물렌 즈로 굴절하여 배경은 어둡게 나타나고 생물체는 밝게 나타나게 해 준다.

 

5.5.3 형광현미경

 

형광현미경 (fluorescence microscope)은 시료를 acridine orangel fluorescein isothiocyanate 같은 형광 염료로 염색하여 관찰할 수 있게 해 준다. 이 현미경이 미 생물학에서 중요한 이유 중의 하나는 형광염료가 세포 내의 특정한 물질과 반응하여 염색방법에 높은 특이성을 제공하는 것이다. 또한 미리 준비한 항체(면역반응에 관여하는 특이한 단백질)를 형광염료와 결합시키면 형광 항체(flurescent antibody)가 되어 이를 항원으로 작용하는 특정한 미생물의 검출이나 계수 등에 이용할 수도 있다. 형광 현미경은 배율이나 해상력의 원리에서 광학현미경과 차이점은 거의 없다.

 

형광현미경의 구조는 그림 5.6에 있다. 위상차 현미경은 특별한 조합의 콘덴서와 대물렌즈를 가지고 있다. 콘덴서는 광 원의 바로 위에 위치한 환상 조리개(annular diaphragm)를 포함한다. 환상 조리개는 시료로 속이 빈 원뿔 형태의 빛을 쪼이도록 한다. 유리를 통과하는 빛 파장은 굴 절하지 않는데 비하여 시료를 통과한 빛 파장은 굴절한다. 굴절의 정도는 빛 파장 이 통과하는 매질(medium)(세포질 또는 막)의 밀도에 따라 다르다.

 

빛 파장(굴절되었거나 굴절되지 않았거나)은 대물렌즈를 통과하여 대물렌즈 안에 있는 위상 전 환 장치(phase shift element)를 지나 실제 상을 생성하는 영상판에 수렴한다(그림 5.7). 생성된 영상은 여러 가지 세포 기관과 배 경간에 높은 대조를 생성한다.

 

5.5.5 전자 현미경

 

모든 물체는 개개의 미립자와 파동과 같은 이중의 성질을 갖는다. 전자(elec trons)는 파동과 같은 성질을 가지며 전자의 파장(A)은 전자가 움직이는 속도에 따라 다르다. 전자의 파장(nm)은 V 볼트의 전위차에서 다음의 식으로부터 계산된다. 이같이 전자는 60 kV에서 0.005 nm의 파장을 가지며 이는 광학현미경보다 탁월 한 해상력을 갖게 한다.

 

전자현미경으로부터 이론적으로 얻어지는 해상력은 실제적으로 이용될 수 없는데 이 해상력은 시료의 대조와 전자기 렌즈(electromagnetic lenses)에 의하여 제한되기 때문이다. 실제 투과 전자현미경(transmission electron microscope, TEM)에서 이용 가능한 해상력은 약 0.2 nm이지만 이는 결정격자를 연구할 때만 사용 가능하다. 세포의 내부구조를 포함하는 생물의 재료를 연구하기 위하여 사용되는 해상력은 약 1nm 정도이다. 전자는 전자기 렌즈를 사용하여 초점을 맞출 수 있으며 TEM은 보통 광학 현미경과 같은 기본적인 원리를 이용하여 제작될 수 있다.

 

전자의 근원은 작은 V자 형태의 텅스텐선이나 음극선이다. 형광 스크린 대신에 사진 기록계(photographic record)나 카메라를 부착할 수 있다. 상의 확대는 주사 전자 광속의 면적과 음극선 스크린의 표면 면적의 배율에 의해 달라진다. SEM의 해상력은 통상 1-10 nm로서 TEM의 해상력보다 낮으나 SEM은 표면의 삼차원적인 입체구조 형상을 보 여준다.