원핵세포(prokaryote)에서의 변이원성시험

tvnhimurium 균주를 이용하여 화학물질의 돌연변이 원성을 단시간에 하이는 방법이다.

 

시험 원리는 Salmonella typhimurium 균의 성장에 필수적인 여하을 하는 histidine 생합성 대사 경로에 결함을 지닌 돌연변이 균주(정상 균주는 자체 내에서 histidine을 스스로 합성할 수 있음)를 이용하여 시험물질에 의한 여위어이(화학물질이 유전자에 영향을 주어 histidine 생합성 경로의 결함이 원 수백 종의 화학물질이 이 방법으로 변이원성 검사를 실시하고 있으나 McCann 등에 의하면 이 시험의 약 1/3만이 정량적인 분석에 적합한 것으로 밝혀졌다.

 

이 와 같은 한계성에도 불구하고 Ames시험을 적절하게 시행하면 변이원성에 대한 재현성 높은 그리고 유의성 있는 결과를 얻을 수 있다. 돌아간다는 의미) 정도를 측정한다. 즉 돌연변이 균주는 histidine이 조재하지 않으면 성장하지 못하지만, 화학물질에 의하여 야생형으로 역 변이원성과 발암 성간의 정확한 상관관계에 대한 의문점은 Ames 시험과 유사한 이 규주로 되면 histidine을 합성할 수 있기 때문에 histidine이 존재하지 안 시험 등이 어떻게 활용되고 있는지를 살펴보는 것이 해결의 열쇠가 된다.

 

예로서 아도 자랄 수 있다. 망간은 Ames시험에서는 변이원성이지만 비발암성이고, diethylstilbesterol은 발암 성이지만 비변 이원성인 경우처럼 약간의 모순점이 있지만 대체적으로 변이원성과 발암 성간의 상관관계는 상당히 높은 것으로 나타났다. 6.3.2 기타 유사시험 변이원성 시험에 활용되고 있는 기타 유사시험들은 아래와 같다. (1) 대장균 역 돌연변이 이 시험은 Ames 시험과 유사하다.

 

Tryptophan을 합성할 수 없는 돌연변이체가 전으로 시험관내 시험은 화학물질대사에 관련된 효소의 활성이 생체내 시험 거에 비해 상대적으로 낮기 때문에 독성의 발생을 쉽게 관찰하기 힘든 점이고, 이러한 문제점을 해결하기 PCBs를 흰쥐에 투여하여 cytochrome 이 호소 활성을 유도하여 간을 균질화시킨 다음 postmitochondria 상등액을 이름하여 S-9 분액)하여 시험관내에 첨가해 준다.

 

S-9 분액은 화학물질이 대사 되어 변이원성 발생에 필수적인 친전 자성 물질을 생산하는데 필요한 효소의 활성을 극대화시키는 역할을 한다. Gamella tvphimurium균 외에도 염기쌍 증감 돌연변이 측정용 미생물로서는 TA-1531 균주가 구조 변환 돌연변이 시험용 미생물로는 TA-1537 균주와 TA-1538 규 추가 개발되었다. 그 외에 돌연변이에 대한 특이성은 떨어지지만 TA-98과 TA-100과 같은 균주도 사용된다.

 

Ames시험과정은 Salmonella typhimurium 균주 현탁액에 보조인자, S-9 분액, 지천 물질, 액상 한천 등을 잘 섞은 다음에 이들 혼합물을 배양액이 들어있는 페리 접시에 붓고 배양한다. 최종 결과는 배양하는 과정에서 histidine이 없는 조건에서도 자랄 수 있는 역 돌연변이된 균수를 계수함으로써 평가할 수 있다(그림 6.9). 그러나 시험물질에 대한 확정 시험은 여러 농도에 걸쳐 실험한 다음에 최종 교전하다. 또한 대조 물질의 사용은 양성 대조군인 경우에는 이미 변이원성이 알려진 물질을, 음성 대조군은 시험물질이 함유되지 않은 물질을 선택하여야 한다.

 

시험 결과에 대한 자료는 통계처리를 거쳐 유의성이 있는 자료로 판정될 때까지 반 tryptophan을 합성할 수 있는 야생형으로의 변이 되는 정도를 평가하는 방법이다. 흰쥐의 간에서 얻은 S-9 분액 역시 효소계 활성화를 위해 이 시험에 이용될 수 있다.

 

(2) Salmonella typhimurium 정 돌연변이 이 시험은 histidine을 필요로 하지 않는 복귀 균주(화학물질에 의하여 histidine 생합성이 가능해진 균주)에서 8-azaguanine에 저항성이 있는 돌연변이 균주의 출현 빈도를 측정하는 방법으로서 역 돌연변이 시험과 마찬가지로 상당히 민감한 방법으로 보고되고 있다.

 

(3) 대장균 정돌연변이 이 시험은 galactose 비발효 대장균이 galactose 발효 대장균으로 돌연변이하는 정도를 평가하거나 5-methyltryptophane 민감성 균주에서 5-methyltryptophane 저항성 균주로 변이 되는 정도를 평가한다. 실험방법은 낳은 지 24시간 이내의 달걀에 초파리를 번식시킨 후 번데기 껍질 이 형성된 다음 2일이 경과한 수컷을 대상으로 시험물질을 처치한다. 이때 수컷 은 X염색체 중 황체에 대한 유전자가 있는 것을 사용한다.

 

(4) DNA 복구 이 시험의 원리는 polymerase가 결핍되어 DNA 복구가 불가능한 대장균은 복구 능이 있는 균주보다 DNA 손상 물질에 더욱 민감하다는 즉 성장이 더욱 억제된다 는 사실에 근거하고 있다. Bacillus subtilis를 이용한 재결합 시험의 경우에서도 재결합 손상 균주는 DNA 손상 물질에 더 민감하다는 것이 밝혀졌다. 용량(LD5o의 25%와 LD50의 50%)에서 살아남은 새끼의 수를 산출하고 다음 교배 시험에 적당한가를 결정한다. 음성 대조군(시험 용액을 조절하기 위해 필요하다면 유화제와 함께)과 ethyl methane sulfonate와 같은 양성 대조군 등을 각 시험에 반드시 포함시켜야 한다.

 

처치 후 각 용량별로 살아남은 수컷과 3마리의 암컷과 10~2, 3~5, 6~8일에 각각 교배시킨다. 이후에 암컷의 새끼를 분리 사육하고, F1 세대의 암수를 다시 자매 교배시킨다. 이때 특정 군의 수컷 새끼들에게서 황체를 확인할 수 없다면 화학물질로 인하여 X염색체에 돌연변이가 일어난 것으로 추정한다. 또한 실험동물들 간에 수컷들과 시기를 달리하여 교배 · 임신한 암컷이 낳은 F2새끼들을 비교함으로써 정자, 정자세포, 정모 세포에 미치는 독성물질의 영향을 쉽게 구별할 수 있다.

 

(3) 기타 관련 시험 일반적으로 시행되는 두 가지 시험방법으로는 첫째는 시험 미생물을 이용한 효모 시험이고, 둘째는 동물을 이용한 마우스 돌연변이에 대한 점적 시험이다. ▷ 효모를 이용한 유전자 돌연변이에 관한 시험의 경우 주로 두 종의 효모를 이용한다. 한 종은 purine 생합성 경로에 관여하는 효소의 정 돌연변이를 나머지