포유동물의 세포 돌연변이 시험

세포의 생존과 복제를 가능하게 하는 세포배양 기술은 세포생물학 전 분야는 물론 cell lines을 이용한 변이원성 물질의 검색 분야에도 많은 발전을 가져왔다.

 

독성시험에 이용되는 세포로서 일차 세포를 이용하는 경우와 cell lines을 이용하는 경우가 있다. D 일차 세포인 경우는 주로 포유동물에서 분리한 관계로 포유동물의 독성시험 에는 이상적이지만 배양하기 어려운 점과 균일한 세포만을 분리하기 어려운 점 등으로 인하여 사실상 활용 빈도가 낮다고 볼 수 있다.

 

▷ 따라서 주로 cell lines이 이용되고 있다. 특히 중국산 햄스터 난소 세포와 마 우스 임파종 세포와 같은 cell lines은 쉽게 균일한 세포로 분리하기가 쉽고 여러 세대에 걸쳐 배양하여도 노화되지 않는 장점으로 널리 사용되고 있다. 그러나 불 행히도 이와 같은 세포들은 외부의 화학물질에 대한 대사활성이 거의 없어 독성 물질을 쉽게 활성화시키지 못하여 변이원성 시험에는 민감도가 상당히 낮은 단 점이 있다.

 

(2) 초파리를 이용한 열성 치사 시험 이 시험의 장점은 초파리가 진핵세포를 갖고 있어 포유동물의 장관 대사와 화 학 물질의 활성화 기전이 다소 비슷하다는 점과 비교적 빠르고 쉽게 시행할 수 있다는 점이 장점이다. 그러나 곤충 호르몬과 면역계가 포유동물과는 다르고, P-450의 특성, 선택성 및 유도 능력에 관한 정보가 포유동물과는 달리 곤충에서는 거의 없다는 것이 단점이다. 한 종은 역 돌연변이를 파악하기 위한 것이다.

 

효모는 독성물질을 대사 시킬 수 있는 P-450을 가지고 있지만 특이성과 감수성이 포유동물과 비교할 때 상당히 제한된 관계로 대사활성을 증가시키기 위하여 S-9 반액을 가한다.

 

▷ 마우스에서 유전자 돌연변이 시험은 특정 부위에 대한 돌연변이 시험으로서 야생형의 수컷에 시험물질을 처치한 다음 표현형에 대하여 열성 돌연변이 특성을 지닌 암컷과 교배시킨다. 교배 후 만약 Fi후손에게서 열성 돌연변이 여부를 확인할 수 있는 돌연변이가 일어나지 않는다면 야생형의 부모와 같은 표현형을 지니 게 된다. 이 시험은 매우 정확하고 자연적 돌연변이율이 매우 낮기 때문에 다른 포유동물에서의 돌연변이 예측에 이용될 수 있다. 그러나 시험에 많은 수의 동물 이 필요하기 때문에 광범위하게 활용하기에는 한계가 있다.

 

(1) 자매 염색분체 교환(SCE : sister chromatid exchange) 시험 SCE는 염색체를 함께 구성하고 있는 자매 염색분체 사이에서 일어나는 변이로서 각 염색분체의 같은 부위에서 일어나므로 염색체 구성성분의 대칭적 교환 방식이다. 최종 생성물이 정상 염색체와 형태학적으로 크게 다르지 않으므로 엄밀히 말해 염색체 이상은 아니다. SCE는 화학물질에 의해 쉽게 발생되며 화학물질의 종양 가능성 및 유전독성 가능성과 관련성이 많다고 볼 수 있다.

 

SCE를 확인하는 대표적 방법이 5'-bromo-2'-deoxyuridine(BDU)을 사용하여 세포를 두 번의 DNA 복제 주기를 거치게 함으로써 확인할 수 있다. 이 경우 세포를 형광색소로 염색한 다음 자외선으로 조사하면 BDU를 함유한 염색분체와 함유하지 않는 염 색 분체 사이에 구별이 뚜렷해진다(그림 6.4). 6.3.4 DNA 손상과 복구 시험 유전자 돌연변이 시험, 염색체 손상 시험, 종양원성 (oncogenecity) 시험에서 주로 활용되고 있는 많은 종류의 종말점이 DNA의 손상여부 혹은 화학물질에 의한 DNA 변이 여부를 판단하는 지표로 개발하였다. 그러나 이들 대부분의 시험에는 DNA 변이 전후에 일어나는 대사이상도 포함되어 있다.

 

(1) 포유동물 세포에서 계획되지 않은 DNA 합성시험 이 시험의 원리는 시험물질로 처치한 세포핵 내부에 3H-thymidine의 삽입되는 정도를 방사선 자동 사진으로 측정하는 방법으로서 DNA 손상 후 세포의 회복 능을 측정함으로써 독성 정도를 간접적으로 평가할 수도 있다. 이 시험의 장점으로는 간세포가 상당한 대사 능을 가지고 있어 DNA 수준에서 의 변이를 측정할 수 있다는 점이며 단점으로는 변이원성 과정에서 일어나는 복 구 오차율과 정상적인 복구 오차율을 명확하게 구별하지 못한다는 점이다. 따라 서 이러한 문제점을 보완하기 위하여 위의 시험을 변형하여 생체 내 계획되지 않은 DNA 합성을 측정하는 시험이 활용되고 있다.

 

(2) 기타 관련 시험들 DNA 손상을 평가하는 또 다른 방법으로는 시험물질에 노출되어 발생하는 DNA 손상 정도를 DNA 사슬의 길이를 측정하여 직접 평가하는 것이다. 이때 DNA의 분리법으로는 알칼리를 이용한 용출법 혹은 sucrose 농도차를 이용한 원 심 분리법이 주로 활용되고 있다. 사용되는 세포는 cell lines 혹은 간세포를 이용하는데, 후자의 경우는 주로 생체 내에서 또는 시험관내에서 처치한 후 시행한다. 효모를 이용하는 재결합 시험과 polymerase가 결핍된 대장균 시험 역시 DNA 복구와 관련된 시험으로 응용될 수 있다. Taxas지역에 서식하는 쥐의 일종인 Peromyscus leucopus에서 발견되는 염색체 이상을 그림으로 표시하였다.

 

6.3.5 염색체 이상 시험

 

염색체 이상 시험은 소수의 유전자에 대한 것보다 전체 염색체에 대하여 화학물 질의 광범위한 독성을 평가하는 것으로 주로 염색체 절단 혹은 염색체 구성성분 그림 6.4 SCE의 발생과정에 대한 실험도 의 교환 등에 관한 것이다. 설치류에서의 우성 치사 시험 우성 치사 시험은 흰쥐, 마우스 또는 햄스터를 이용하여 변이원성 물질에 대한 생식세포 독성을 결정하는 시험이다. 시험방법은 시험물질로 처치한 수컷을 정충 생성과정을 포함한 충분한 기간에 걸쳐 매주 다른 암컷들과 교배시키는 방식으로 진행시킨다.

 

임신 2주 후 암컷들을 치사시켜 황체 존재 여부 및 착상된 새끼수를 확인한다. 우성 치사 돌연변이 가능성을 결정하는 데 사용되는 종말점으로는 수 정지수(교배된 암컷에 대한 임신한 암컷의 비율), 착상전 손실(황체수에 대한 착 상수), 임신한 총 암컷 수에 대한 죽은 새끼를 착상하고 있는 암컷 수 혹은 및 착 상 총수에 대한 죽은 착상수 등이 주로 활용되고 있다.

 

(4) 기타 관련 시험 기타 시험물질에 노출된 많은 세포들의 염색체 이상 여부는 염색하여 현미경을 그림 6.5 Peromyscus leucopus에서 발견되는 염색체 이상 (그림에서 화살표는 염색체의 일부가 결손 된 형태)로 관찰할 수 있다. 현미경 관찰에 주로 사용되는 세포는 중국산 햄스터 난소 배 이 시험의 특징은 생체 내에서 처치한 세포에서도 가능하다는 점에서 그동안 양 세포, 생체 내로 처치한 동물의 골수 세포 또는 임파구 등이다. 염색체 이상의 형태로는 대개 염색분체의 결함·절단·결손, 염색체의 결함·절단·결손, 염색체 단편, 전위 및 배수 등이 있다.

 

6.3.6 포유동물의 세포 변이 시험

 

이 시험은 태아 조직에서 분리한 섬유아세포를 배양하여 시행한다. 초기의 연 구에서는 C3H 마우스의 섬유아세포를 발암물질로 처치하여 형태 변화나 성장 패 턴의 변화 등을 관찰하였다. 세포 변이와 발암성과의 직접적인 상관관계는 세포 암환자, 화학요법제를 투여한 암환자, 흡연자 및 직업적으로 노출된 근로자의 임 파구 등 현장에서 바로 SCE를 분석하여 왔다. 이 시험은 DNA 알킬화제에 민감하고, phorbol ester 같은 촉진제의 검출에도 유용하게 활용될 수 있다.

 

(2) 소핵(micronucleus) 시험 소핵시험은 보통 마우스를 대상으로 생체 내에서 실시한다. 실험동물을 시험 물 질로 처치한 후 골수의 적혈구 간세포를 염색하여 유사분열 말기에 염색체나 염 색체 단편에 존재하는 소핵의 존재 여부를 관찰한다.

 

일반적으로 이 시험은 염색 체를 파괴하거나 방추사 기능에 영향을 주는 화학물질 그리고 정상적인 유사분 열을 방해하는 화학물질에 대한 독성시험이다. 급성, 아만성, 만성 시험에서 이미 언급한 대로 최적의 조건에서 사육한 암수 마우스를 이종 교배하여 시험물질을 LD50의 50% 농도 또는 LD5O의 10% 농도 등으로 처치한다. 이후 수시간 간격으로 이틀 동안 동물을 치사한 다음 골수를 적 를 숙주 동물에 이식하였을 때 종양이 발생한다는 사실로 확인된다.

 

최근에 마우 스 태아에서 얻은 Balb/3T 3과 C3H/10T1/2 두 종류의 cell lines을 이용하여 세포 변이를 쉽게 확인할 수 있는 실용적인 검색 방법이 개발되었다. 구체적인 실험방법으로는 Balb/3T3 마우스 섬유아세포를 단층이 형성될 때까 지 배지에서 계속 번식시키면서 시험물질을 처치한다.