제5장 실험 방법론

5.1 서론

 

미생물들은 크기가 작아 일상적인 방법으로 각 세포들의 취급이 불가능하기 때문 에 그들에 대한 세부 연구가 어렵다. 더욱이 이들의 넓은 분포와 여러 집단들의 다 양성은 많은 경우에 주어진 표본이 매우 많은 서로 다른 종류를 포함하고 있다는 것과 실험실에서 관심의 대상이 되는 종 또는 집단의 선택적 분리와 배양에 대한 기술 없이는 식별이 어렵다는 것을 의미한다. 그러므로 세균과 다른 단세포 생물체는 특정 조건하에 순수 배양의 형태로 동일종이 많은 개체수로 존재하는 개체군 (population)의 수준에서 일반적으로 연구된다.

 

5.2 미생물학

 

실험에서의 안전수칙 미생물을 배양하거나 오염된 시료를 다루는 실험실에서 작업을 할 경우 오염된 시료 또는 배양체와 접촉하는 모든 배양체와 시료, 물질들은 병원균이 있을 가능성 이 있기 때문에 조심해서 처리되어야 한다. 피부와 의복의 오염을 피하고 오염된 물질의 섭취 또는 흡입을 막기 위한 단계들이 취해져야 한다. 공기로 전파되는 생 물체의 흡입은 흔히 위험에 관한 한 과소평가되는데 초자 배양용기의 파괴나 열린 용기에서 오염된 액체를 과도하게 진탕 하는 경우 작은 부유입자인 에어로솔(aero sol)로 분산되어 일어난다.

 

작업 환경에서는 병원균의 일반적인 발생이 낮지만 많은 실험실 기술의 대부분은 자연환경에서 그들의 정상적인 생장과 비교해볼 때 빠르고 대량 증식하는 미생물의 최적 생장의 계획적인 증가라는 것을 명심해야 한다.

 

5.3 무균기법

 

5. 3.1 멸균

 

멸균(sterilization)은 특별한 물질과 관련되어 있는 모든 살아있는 생명체를 제거하거나 파괴하는 처리 과정이다. 멸균처리 후 잔여 물질이 오염의 가능성이 있는 외 부원에 노출되지 않으면 멸균은 영구적인 효과가 있다. 멸균은 치명적인 물리적 혹 은 화학적 요인들을 이용하여 의문시되는 물질을 처리하거나 또는 여과에 의해 액 체로부터 미생물들을 선택적으로 제거함으로써 이루어질 수 있다.

 

(a) 열열(heat)은 멸균하는데 가장 널리 사용되는 요소이다. 실험실 초자류, 피펫, 금속 물질들과 그 밖의 열 저항성 품목들은 170°C 이상의 온도에서 2시간 동안 온도가 조절되는 오븐(oven)에서 멸균 처리될 수 있다. 모든 멸균방법들처럼 치명적 요인의 침투에 대한 충분한 준비가 이루어져 있어야 한다. 가령 오븐에 질서 정연히 잘 채 워져 있거나 초자류가 금속용기 내에 완전히 밀폐되어 있다면 3시간가량의 충분한 열처리를 해야 한다. 건열 멸균기(hot air oven)는 액체나 플라스틱을 포함하는 열에 약한 물질들에게 적합하지 않다. 이런 경우 멸균은 낮은 온도에서 효과가 있는 습열(moist heat)을 통해서 얻어질 수 있다. 수용성 용액을 끓이는 방법은 존재하는 대부분의 영양 생물 체를 죽일 수 있으나, 이 방법도 일단 끓였다 식힌 배지에서 발아하여 성장하는 세 균의 내생 포자에는 적합하지가 않다. 가열 주기 사이에 발아하는 세균의 포자를 죽 이기 위해서는 3일에 걸쳐 매일 30분씩 100°C에서 가열한다. (15 lb/in)의 압력에서 얻어진다. 공기가 존재하면 온도와 열 투과 정도가 줄어든다. 조작되어야 한다.

 

(b) 여과 (filtration) 이 방법은 액체 배양 배지나 열에 민감한 물질을 포함하는 용액들에 효과적이다. 여재(filter)는 도기나 석면으로부터 만들어지나 이들 대신에 셀룰로오스 아세트산이나 유사한 물질들에서 유래하는 현대적인 막여과재(membrane filter)가 사용되어 왔다. 공극이 0.45 mm인 필터는 세균 세포를 걸러내는 데 사용되나 보다 작은 종의 세균은 0.22 mm의 필터에서 완전히 제거된다. 그러나 이들 크기의 막여과 재는 현탁 액에서 바이러스를 제거할 수 없다. 필터는 여과장치의 하부를 형성하는 다공성 지지체 위에 올려놓아진다. 이것은 상부 용기에 고정되어 그 조립체는 비 흡착성의 면화 솜으로 막힌 측면 연결부위 (side arm)를 갖는 횟수 플라스크에 차등 팽창으로 인한 파손을 막기 위해 약하게 연결된다. 이 장치는 유산지 또는 유사 재료로 포장하여 고압 멸균시킨다. 식힌 후 연 결부분을 조이고 멸균시키고자 하는 용액을 플라스크 측면 연결부위에 가해지는 진 공에 의하여 필터를 통과시킨다(그림 5.1).

 

(c) 기타 방법들 자외선이나 X-선 조사(irradiation)가 멸균하는 데 사용될 수 있다. 전자는 투과가 잘 안되기 때문에 이용이 제한되어 있다. 예를 들면 자외선은 유리를 통과할 수 없으며 제한된 정도로만 물을 투과할 수 있다. 몇몇 상업적으로 이용되는 품목들이 만들어지는 과정에서 X-선에 의해 멸균되지만 실험실에서는 일상적으로 사용되지 않는다. 쉽게 물에 용해되는 기체인 에틸렌옥사이드(ethylene oxide)는 유리제품 등 을 멸균하는 데 사용될 수 있으나 그것의 높은 유독성 성질과 처리한 품목에 잔여물 이 존재할 수 있는 가능성 때문에 사용이 제한된다.

 

5.3.2 소독

 

소독(disinfection)은 감염의 가능성이 있는 미생물들을 불 활성화시키는데 주로 사 용 된다는 점에서 멸균과 다르다. 일반적으로 이용되는 소독용액들은 페놀 화합물이 나 차아염소 산염(hypochlorite)을 바탕으로 하고 있다. 이들은 일반적으로 예비 멸균 에는 사용되지 않는다. 실험실에서 이들은 주로 실험대를 닦거나 사용된 피펫과 현 미경의 슬라이드를 버리는 용기에 사용된다.

 

5.3.3 접종과 무균 전달(aseptic transfer)

 

많은 실험실에서의 작업이 순수배양의 연구에 바탕을 두고 있기 때문에 접종 또 는 전달하는 동안에 오염을 방지하기 위해서 주의를 해야만 한다. 몇몇 연구실에서 는 여과된 공기를 공급하기 위해서 laminar flow hood를 갖추고 있으나 대부분의 연구실에는 이런 장치가 없다. 바람이 잘 통하지 않는 지역의 무균 상자(clean bench)에서 작업을 하면서 배지와 멸균한 용기를 가능한 짧은 시간 내에 대기 중에 노출시킴으로써 오염을 방지할 수 있다. 작업은 분젠 버너의 불꽃 부근에서 실시하며 이 분젠 버너는 잠시 노출된 표면의 오염을 제거하기 위해 사용된다.

 

고체배지에서 자라고 있는 미생물들을 옮길 때에는 한쪽 끝에 지름이 대략 5mm 되는 고리 형태의 백금이나 니크롬선이 자루에 연결되어 있는 백금이(loop)를 이용 치고 액체 배양 배지를 옮기는데도 사용된다. 백금 이를 분젠 버자는 투과가 통과할 수 없는 품목들이으로 사용되지 - 유리제품 등 들목에 잔여물 은 사용하기 전에 분젠 버너의 불꽃에 순간적으로 통과시키는 것이 좋다.

 

미생물을 옮길 때 시험관 또는 배지 플라스크의 솜마 개나 병의 나사 뚜껑(screw cap)을 제거하고 옮기기 전이나 후에 용기의 주둥이 부분을 순간적으로 화염 멸균한 다. 뚜껑(cap)이나 마개(stopper)의 내부 표면을 제자리에 두기 전에 간단하게 화염 멸균한다. 이런 조작들을 불꽃 가까이에서 하며 마개를 제거한 시험관 용기를 분젠 버너 쪽으로 비스듬하게 하면 상승 공기로 인해 공기 중에 떠다니는 미생물이 시험관 용기 안쪽에 들어가는 것이 방지된다.