만성 독성시험

만성 독성시험은 대부분 실험동물의 생존기간 혹은 또는 한 세대 이상에 걸쳐 시행하며 관련된 중요시험으로는 만성독성, 발암성, 최기형성 및 생식독성 등이 있다.

 

(1) 만성독성과 발암성 입 반적으로 만성 독성과 발암성에 관한 시험은 같이 시행하지 않지만, 실험과정 이 유사한 관계로 통합하여 시행하기도 한다. 만성 독성시험의 목적은 다양한 화학물질 규제하기 위하여 독성을 확인하여 안 전역을 설정하는 것이다. 만성 독성시험에서 이용되는 실험동물은 두 종으로서 이 중 한 종은 설치류인 흰쥐 또는 마우스 계통이어야 하며 시험기간은 각각 2~2.5 년과 1~2년이다.

 

만약 비설치류를 사용한다면 개, 인간을 제외한 영장류 뿐만 아니라 최기형성 시험 분야에서 사용되고 있는 용어가 광범위하고 전문적 이어서 연구팀마다 나름대로의 문제점을 안고 있는 실정이다. 현재 통용되고 있는 가장 일반적인 시험 네 가지 분야 중 대표적인 두 분야만 설명하면 다음과 같다. • 번식력과 일반적 생식능 - 단일세대 시험 • 번식력과 일반적 생식능 - 다세대 시험 • 기형 발생 시험 • 화학물질이 임신 말기와 수유기에 미치는 영향 1 번식력과 일반적인 생식능(단일세대 시험) : 번식력과 일반 생식능에 대한 단 일 세대 시험은 보통 흰쥐를 사용한다(그림 6.1), 전형적인 시험에서는 수컷 20마리는 교배 이전 60일 동안 시험물질로 처치하고, 암컷 20마리는 교배 이전 14일 동 안 처치한다.

 

이와 같은 처치 시기는 정자 형성과 배란이 일어나는 시기를 일치시키기 위해 필요하며 교배 후에 암컷에 대한 처치는 임신 후 새끼들을 이유 할 때까지 계속 담비와 같은 작은 육식동물을 사용한다. 만성 독성시험 역시 시험물질을 사료에 섞거나 음료수에 녹여서 투여하지만 특별한 경우에는 위에 강제로 주입할 수도 있다.

 

시험에 사용되는 용량은 최대 허용량(MTD : maximum torelance dose), 0.25 MTD, 0.125 MTD이다. 여기서 MTD는 미국 환경보호청에 의해 다음과 같이 정의된다. “잘 사육된 대조군과 비교하여 10%의 체중 감소를 초래하지 않는 최 고용량으로서 향후 사망, 임상적 독성 징후, 자연수명을 단축시킬 것으로 예견되는 병리적 병변 등을 일으키지 않는 양이다. MTD의 경우 아만 성독 성 시험 자료를 활용하여 외삽으로 산출할 수도 있다.

 

동물의 사육조건은 아만성독성시험과 동일하다. 만성 시험에서의 활용되고 있는 종 말 점은 주로 외형, 눈, 사료 소비량, 체중, 임상적 현상, 행위 현상, 혈액학, 혈액화 학, 소변 분석, 배설물 분석, 기관 중량 및 조직 등에 관한 자료이다. 일부 동물은 시험기간 동안 일정한 간격 (6, 12, 18개월)으로 죽여서 조직검사를 행한다. 발암성시험은 만성 및 아만 성독 성 시험에서 이미 언급한 일반적인 여러 가지 조 건을(물리적 시설 · 사료 등) 맞출 필요성이 있다. 소요되는 시간과 동물의 수를 고려하여 대부분 경우 흰쥐 또는 마우스를 사용하지만, 경우에 따라서는 비설치류도 사용한다.

 

시험물질 투여방법은 동물의 이유기로부터 일생(마우스의 경우 1.5~2년, 흰쥐 의 경우 2년 이상)에 걸쳐 시행하며 투여 용량은 일반적으로 보통 MTD와 0.5 MTD를 함께 사용한다. 종말점은 조직검사로 관찰되는 종양이며 이 경우 대조군에서 의 자발적인 종양 발생률과 시험물질을 처치한 동물에서의 종양 발생률 간 통계적 유의성을 얻을 수 있을 최소한의 동물수가 필요하다.

 

일반적으로 한 동물종에 대한 독성시험의 경우 대략 300마리 이상이 필요하다. 즉 MTD에서 암수 각각 50마리씩과 최대 허용량의 반 용량에서 또한 암수 50마리씩 그리고 대조용으로 각각 50마리의 암수가 필요하기 때문이다. 참고로 만성 및 발암성시험의 경우 조직학적 검사가 필요한 장기를 표 6.6에 표시하였다.

 

(2) 생식독성 및 최기형성 시험한다. 투여용량의 결정은 고용량은 과도한 모체 독성을 일으키지 않는 용량으로 저용량은 사람에게 노출이 예상되는 양 혹은 독성을 일으키지 않는 조직 내 농 도 측정이 가능한 양으로 잡는다. 독성의 정도는 용량-반응 곡선을 이용하여 구 할 수 있다. 교배 여부는 흰쥐를 암·수 한 마리씩 같은 공간에 넣은 후 흰쥐의 질 분비물을 채취하여 정자의 유무 여부를 확인하면 가능하다.

 

마우스의 경우에는 점액봉 (vaginal plug)의 형성으로 확인이 쉽다. 임신 첫날이 수정이 확인되는 날이다. 암 컷의 반을 임신 중간에 검시하여 착상 전후의 새끼들에 대한 치사율을 관찰할 수 있다. 나머지 암컷은 새끼를 낳고 3~4일 후에 일정한 수의 새끼를 보통 10 마리 골라내어 이유기 동안 전체적인 기형 여부를 조사한다.

 

(3) 최기형성 시험 최기형 발생 시험은 보통 구조적 기형 발생에 가장 민감한 장기 형성시기로 제한하는 것이 원칙이지만 일반적으로 착상에서 출산까지 시험물질에 노출시킨다. 기 형 발생 여부는 전 생애에 걸쳐 확인할 수도 있지만 일반적으로 출생 직전에 확인한다. 종말점으로서는 태아의 사망이 사용될 수 있지만 주로 형태학적인 변형 즉 구조상의 변화나 기형이 된다. 대표적인 실험 과정을 그림 6.3에 제시하였다.

 

최기형성 시험에는 보통 설치류의 흰쥐를 이용하지만 간혹 토끼 등의 다른 종도 이용되고 있다. 실험동물의 수는 설치류의 경우에는 20마리의 임신한 암컷을 비 설치류의 경우에는 10마리의 임신한 암컷이 있어야 한다. 투여용량의 결정은 고 용량은 약간의 모계 독성이 나타나는 양이나 사망률이 10% 미만의 양으로 저용량 은 모계 독성이 나타나지 않는 양으로, 그리고 중용량은 고용량과 저용량 사이의 중간 용량으로 잡는다. 세대 시험 역시 일반적으로 설치류인 흰쥐를 사용한다(그림 6.2), 시험물질을 Fo세 대의 이유기로부터 암수에 동시 투여하여 계속 3세대까지 투여한다.

 

투여용량은 고용량은 LD:o의 약 1/10, 저용량은 아만 성독 성 시험처럼 F세대의 어미나 태아에 독성을 나타내지 않는 양, 중용량은 고용량과 저용량의 중간 용량으로 잡는다. 실험동물의 경우 각 세대에서 용량당(대조 용도 포함) 20마리의 임신한 암컷이 있어 주로 모계 관련 독성을 평가하는데 유용하다. 배아-태아 독성은 죽은 태아수와 착상 부위의 수를 흡수 부위와 관련지어서 결 정한다. 배아 태아 독성은 치사적 기형 가능성 이외에 모계 독성, 스트레스 또는 기형과 관련되지 않는 배아나 태아에 대한 직접적인 독성에 기인될 수 있다. 고 용량에서의 태아독성은 낮은 용량에서 발생할 수 있는 최기형 성독 성과 구별될 수 있다.

 

6.3 시험관내(in vitro)

 

시험과 기타 단기 시험들 질의 영향을 측정할 목적으로 동물의 조직에서 분리한 세포를 대상으로 실험한 다. 특히 단기간 독성시험의 경우에는 실험 목적에 대한 접근방식, 작용기전과 실 험목적의 유사성 때문에 생체내 시험과 시험관내 시험을 병행하는 경우가 많다. 왜냐하면 일반적으로 시험관내 시험은 화학물질의 발 암기 전을 단기간에 파악할 수 있을 뿐만 아니라 발암성과 관련된 배아 세포의 변이원성 문제 그리고 변이 된 유전자의 다음 세대로의 유전 경향에 대한 정보를 얻을 수 있기 때문에 생체내 그림 6.3 Ames시험 과정 시험 못지않게 중요하다.

 

일반적으로 화학적 발암의 첫 단계가 체세포 돌연변이라는 이론은 널리 인정돼 고 있다. 돌연변이성과 발암성은 서로 관련된다는 상당한 증거가 있다. 따라서 화 학 물질의 발암 가능성을 조기에 파악할 목적으로 많은 시험 방법들이 개발되고 있다. 대표적인 시험 방법과 특성을 소개한다. 쥐 나 마우스의 경우에는 임신 6~15일, 토끼의 경우에는 6~18일이 적당하다. 이때 최초 1일의 설정은 흰쥐나 마우스의 경우는 질 내에 정자가 나타나거나 점액 봉이 형성되는 날이며 토끼의 경우는 교배시킨 날이다.

 

독성시험은 정상적 분만 예정 하루 전날에 어미를 해부하여 착상과 흡수 부위, 태아의 생사, 황체를 생성하는 난소 등을 검사한다. 설치류의 연구에는 태아의 1/3은 연질 조직의 기형을, 나머지 2/3은 골격의 기형을 검사하며 비설치류에서는 모든 태아를 연질 조직과 골격의 기형검사에 사용한다. 주로 활용되는 종말점으로 는 모계 독성, 태아독성, 외형적 기형, 연질 조직과 골격 기형 등이 있다.